Biochrom30+氨基酸分析仪氧化水解法检测玉米胚芽粕中氨基酸

2021-08-31

Biochrom30+氨基酸分析仪氧化水解法检测玉米胚芽粕中氨基酸

                                              

一、样品前处理

1、所用试剂

必须使用重蒸馏水或与之等质的水(电导率<10μs)

1、1          双氧水,30%

1、2          甲酸,98-100%

1、3          苯酚:须重蒸

1、4          偏重亚硫酸钠

1、5          氢氧化钠

1、6          盐酸,ρ=1.18g/ml

1、7          水解剂:6mol/l 的HCL,1L含1g苯酚:

加1g苯酚(3.3)到492mL盐酸(3.7)中,然后用水定容至1L

1、8          20种氨基酸标准品

行号

氨基酸

行号

氨基酸

1

CYS-OX

磺基丙氨酸

2

TAU

牛磺酸

3

MET-SO2      

蛋氨酸砜

4

ASP

天冬氨酸

5

THR

苏氨酸

6

SER      

丝氨酸

7

GLU

谷氨酸

8

PRO      

脯氨酸

9

GLY

甘氨酸

10

ALA       

丙氨酸

11

VAL       

缬氨酸

12

MET

蛋氨酸

13

ILE        

异亮氨酸

14

LEU

亮氨酸

15

NLE       

正亮氨酸

16

TYR

酪氨酸

17

PHE       

苯丙氨酸

18

HIS

组氨酸

19

LYS

赖氨酸

20

ARG

精氨酸

 

2、标样配置

   氨基酸混合标准储备液:称取上述各氨基酸标样使用PH2.2的Load Buffer配置成2.5umol/L的储备液备用。

  取氨基酸混合标准储备液与PH2.2的Load Buffer以1:9的比例配置成0.25umol/L的标准液。

3、前处理设备

1)       天平

2)       水解管

3)       量筒

4)       无油真空泵

5)       干浴水解、浓缩仪

6)       移液管

7)       0.45um滤膜

4、   样品制备(参考欧盟饲料指令98/64/EC )

1、样品的准备

粉碎样品,通过0.5mm的筛孔。高水分的样品粉碎前必须低于50℃鼓风干燥或者冷冻干燥。高脂肪含量的样品粉碎前必须用轻质石油(3.12)脱脂。

2、氧化

从准备好的样品中称取约0.1~1克样品,准确到0.2mg,于100 ml带螺纹盖子的瓶子中,称取的样品应该含有大约10mg氮,水分不能超过100mg。将瓶子放于冰水浴中冷却至0℃,加5ml氧化试剂(过甲酸苯酚),用带弯头的玻璃刮勺混合。用空气密封膜将瓶子和刮勺一起密封,密封后一起放入0℃冰箱的冰水浴中,放置16小时。之后,从冰箱中取出,加0.84克偏重亚硫酸钠(3.4)来分解过量的氧化试剂。

3、水解

 加入25毫升盐酸-苯酚溶液, 然后将反应瓶放在烘箱中,温度控制在110摄氏度,旋松帽子(防止玻璃瓶子破裂),水解1小时。然后快速旋紧瓶塞(戴手套和护眼罩)将其继续在烘箱110摄氏度下水解23小时。

4、加入内标并且调节pH值到2.20

    当水解反应结束后,将反应瓶从烘箱中取出,并且打开瓶口(戴手套和护目镜)。冷却后用定量加样器准确加入15.00克(15毫升)正亮氨酸标准溶液,混合并且转移水解溶液到250毫升的塑料烧杯中。加入大约125毫升柠檬酸缓冲液和19毫升氢氧化钠水溶液,将实验烧杯放入到样品容器中用氢氧化钠水溶液将溶液调节到pH为正好2.20。

转移一部分溶液(不需要全部)到50毫升有盖子的塑料瓶中。可以马上测定或者放入冰箱等到分析的时候测定。

二、分析方法描述(Biochrom 30+)

氨基酸分析仪分析方法参数:

1)       色谱柱:Biochrom Na型阳离子交换树脂柱,4.6′20cm

2)       分离程序:

NO.

Time

Temp

Buffer

Pump

Nin

Rec

Commands

1

01:00

53

3

35.0ml/h

ON

OFF


2

00:00

53

3

35.0ml/h

ON

OFF

Reset

3

03:30

53

3

35.0ml/h

ON

OFF

Load

4

15:45

53

1

35.0ml/h

ON

ON


5

12:00

58

2

35.0ml/h

ON

ON


6

02:00

58

4

35.0ml/h

ON

ON


7

26:00

92

4

35.0ml/h

ON

ON


8

04:00

92

6

35.0ml/h

ON

ON


9

04:00

92

3

35.0ml/h

ON

ON


10

14:00

53

3

40.0ml/h

OFF

OFF


11

02:45

53

3

35.0ml/h

ON

OFF


End








 

3)       运行时间:分析时间65min

4)       反应单元温度:135°C。

5)       检测波长:570nm、440nm同时检测。

三、外标法定量

附、玉米胚芽粕分析图谱

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